光片顯微鏡（大樣品組織器官成像系統(tǒng)）—LSM

類器官3D成像系統(tǒng)

       傳統(tǒng)顯微鏡的小范圍的成像并不能反映組織的生物學(xué)狀態(tài)，而采用傳統(tǒng)的連續(xù)切片法又很容易導(dǎo)致樣品扭曲變形。因此迫切需要一種能夠?qū)崿F(xiàn)大樣品塊、快速掃描、深度成像、高分辨率3D動(dòng)態(tài)圖像輸出的熒光顯微鏡。而光片顯微成像系統(tǒng)滿足了科研人員的這種需求。

光片顯微鏡系統(tǒng)用于細(xì)胞水平、透明化處理后腦、小鼠胚胎、組織、器官的大樣品整體成像或者斑馬魚等活樣品成像；在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞毒作用、受體蛋白轉(zhuǎn)位、蛋白相互作用等許多方面都有很好的應(yīng)用，可用于細(xì)胞生物學(xué)，系統(tǒng)生物學(xué)，類器官培養(yǎng)后的評估以及腫瘤學(xué)等研究。 功能用途：光片顯微成像系統(tǒng)應(yīng)用范圍十分廣,可用于透明化處理后腦、小鼠胚胎或者器官，包括骨骼、脊髓、軟骨以及四肢等大樣品整體成像或者斑馬魚活樣品成像。

借助于光片照明顯微鏡，發(fā)育學(xué)家可以觀察到動(dòng)物和人類胚胎模型各個(gè)階段的組織狀態(tài)，神經(jīng)學(xué)家能夠輕松的研究神經(jīng)元的再生能力并探究新的神經(jīng)傳導(dǎo)途徑，腫瘤學(xué)家可以準(zhǔn)確的篩選血管抑制劑類藥物，免疫學(xué)家能夠研究淋巴系統(tǒng)整體的發(fā)育過程。光片顯微成像系統(tǒng)除了可以觀察透明化的樣品外，還可以實(shí)現(xiàn)動(dòng)物的體內(nèi)成像。對于表達(dá)內(nèi)源性熒光蛋白或者標(biāo)記了熒光抗體的組織也可以快速便捷地成像。

光片顯微鏡—LSM的系統(tǒng)化服務(wù)方案包括專業(yè)化的硬件、專業(yè)化的軟件、透明化方案、技術(shù)服務(wù)

適用于各種水性和有機(jī)透明劑處理后的樣品成像，同時(shí)適用于各種自然透明模式生物的成像；

支持各種折射率的透明劑，可軟件設(shè)定透明劑折射率以使所用光片與透明劑折射率相匹配，包括水及所有透明試劑（/cubic/scale/TDE/ClearT/Clarity/SeeDB/BABB/THF-DBE/Fruit等）；

適合樣品尺寸范圍為5μm到2 cm，視野范圍從6 mm至87 mm；

樣品池電動(dòng)行程：2cm x 2cm x 2cm (X - Y - Z)； 可對大尺寸樣品進(jìn)行單細(xì)胞分辨率的深層成像，可觀察超厚樣品，成像深度可達(dá)2 cm，成像尺寸約為2 cm X 2cm X 2 cm；

采用2光片照明方式，光片厚度約為2.7微米到24微米可調(diào)，具有極低的光漂白與光毒性； 

采用雙側(cè)光片照明方式，可以消除圖像中的陰影；

光片水平方向可自動(dòng)調(diào)整聚焦點(diǎn)位置，支持動(dòng)態(tài)水平對焦功能，以保證大樣品成像時(shí)圖像各處都能達(dá)到的成像質(zhì)量（包括手動(dòng)移動(dòng)光片，自動(dòng)步進(jìn)式移動(dòng)光片，自動(dòng)連續(xù)移動(dòng)光片）；

采用多波長激光器，標(biāo)配405nm，488nm， 532nm,  633nm ，其他波段可選，最多可同時(shí)配置6個(gè)波長；

可配備0.63X齊焦電動(dòng)變倍體，具備0.63X~6.3X光學(xué)連續(xù)變倍體，整套設(shè)備的放大倍數(shù)為1.26X~12.6X；

可配備0.63X，1X，2X物鏡；

可配備高分辨率多浸成像模塊，10X物鏡（NA 0.5，工作距離5.5mm，）， 20X的定倍物鏡（NA 1.0， 工作距離8.2mm）；

高分辨率相機(jī)：sCMOS，分辨率為2048 x 2048，幀速100 fps@全幅分辨率，用于快速功能成像；

軟件可實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)獲取與處理，并控制所有硬件，進(jìn)行成像控制及光片照明控制。支持多通道快速切換；

支持多視場自動(dòng)成像拼接，Z-stack，時(shí)間序列（含XYZT）成像，多維(x, y, z, t, λ)數(shù)據(jù)堆棧與分析。

光片顯微鏡樣品處理-組織透明化技術(shù)

如今，組織樣品的透明化已經(jīng)成為神經(jīng)生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等研究領(lǐng)域中的核心技術(shù)手段。

為什么要進(jìn)行組織透明化處理？

傳統(tǒng)的成像技術(shù)在觀察大型生物樣品時(shí)，一般采用連續(xù)切片法，然后將組織的切片置于顯微鏡下觀察，最后通過軟件將圖像進(jìn)行整合形成立體影像圖。然而這種連續(xù)切片的方法很容易破壞組織的原有形態(tài)，對組織造成不規(guī)則的扭曲，導(dǎo)致不可逆的破壞。那么如何才能避免光的散射、吸收以及發(fā)射造成的影響從而獲得真實(shí)的全組織三維圖像呢？組織透明化技術(shù)的出現(xiàn)非常好的解決了這些問題。“clearing-透明化”這一概念由Werner Spalteholz 在1911年進(jìn)行了詳細(xì)的闡述。他開發(fā)出了的組織透明化方法之一：用甲基水楊酸酯/苯甲酸苯甲酯（5:3）混合液對組織進(jìn)行透明化處理，而當(dāng)時(shí)也有學(xué)者使用含有丁香油或者二甲苯的香脂來做透明化處理。隨著技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)有的組織透明化處理的方案大約有30多種，主要分為兩類：基于水溶性緩沖液的方案和基于有機(jī)溶劑的方案。

一、基于水溶性緩沖液的組織透明化方案：

水溶性緩沖液的組織透明化方案有很多種，根據(jù)原理又可以分為三類：水凝膠法（hydrogel）、水化法（hyperhydration）和浸入法（immersion）。

（1）水凝膠法

CLARITY技術(shù)、PACT &PARS技術(shù)、SE-CLARITY技術(shù)、SWITCH技術(shù)、EDC-CLARITY技術(shù)和ACT-PRESTO 技術(shù)可歸為水凝膠法。該方法需要先用水凝膠將組織進(jìn)行固定，然后利用SDS電泳去除脂肪，具體步驟可以參考CLARITY技術(shù)。這種方法的好處在于能夠完整的保留內(nèi)源性的熒光蛋白，同時(shí)組織基本不會膨脹。每種組織需要采用不同的技術(shù)手段，并且做特定的優(yōu)化處理。可以將組織浸入到FocusClear，RapiClear，80％甘油，63％TDE，sRIMS或RIMS之中進(jìn)行成像。這些溶液的價(jià)格大為8-6000美金/500 ml，其中8美金的sRIMS溶液或者63%的TDE溶液是的。

（2）水化法

水化法的主要代表是CUBIC技術(shù)，使用尿素、氨基醇類等多種試劑的混合液對組織進(jìn)行浸泡處理，能夠?qū)崿F(xiàn)對小鼠腦甚至整個(gè)小鼠的透明化。經(jīng)過reagent-1處理之后，還需要reagent-2浸泡，根據(jù)樣品的大小，浸泡時(shí)間大概需要12天。CB-perfusion 技術(shù)[8]采用稀釋的溶液-1進(jìn)行浸泡可以有效的提高富含血液組織的脫色效果，然后再用CUBIC reagent-2浸泡。處理后的樣品可長期保存于50%礦物油+50%硅油混合物中。其他的水化法的技術(shù)還有Scale技術(shù)[9], ScaleA2技術(shù)[9] 和 ScaleS技術(shù)，這些技術(shù)所需的浸泡時(shí)間比較長，可能需要數(shù)周，因此組織可能會膨脹的更明顯。

（3）浸入法

SeeDB技術(shù) 和FRUIT技術(shù)屬于浸入法，其共同點(diǎn)在于使用高濃度的果糖浸泡后，組織可以變得透明。然而在成年動(dòng)物或者致密的組織中，經(jīng)過浸泡處理可能會增加成像背景并降低透明度。Viscose緩沖液浸泡后由于殘留的氣泡會降低成像質(zhì)量。SeeDB2技術(shù)的浸泡緩沖液是和皂素的混合液，ClearT技術(shù)相對比較簡單，適用于胚胎組織的透明化。

二、基于有機(jī)溶劑的組織透明化方案：

水溶性緩沖液的組織透明化方案有很多種，根據(jù)原理又可以分為三類：水凝膠法（hydrogel）、水化法（hyperhydration）和浸入法（immersion）。

基于水溶性緩沖液的組織透明化方案成本比較高而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，同時(shí)由于解聚化試劑的使用使得組織明顯膨脹，在某些情況下由于組織的不透明性甚至?xí)璧K處理的程序。而基于有機(jī)溶劑的組織透明化方案能夠彌補(bǔ)這些不足。基于有機(jī)溶劑的組織透明化方案在幾個(gè)小時(shí)之內(nèi)就可以完成組織的初步透明化。而針對那些比較致密和比較大型的組織，比如成年動(dòng)物的腫瘤或者器官可以在兩天內(nèi)完成透明化。而且有機(jī)溶劑透明化方案花費(fèi)也比較少，一般在幾美金左右。基于有機(jī)溶劑的組織透明化方案主要為兩步：步脫水，第二步透明，最終的折射率達(dá)到1.33。最初由Spalteholz發(fā)展的透明方法經(jīng)過修正和優(yōu)化之后很快就成為標(biāo)準(zhǔn)的方法。使用甲基水楊酸酯/苯甲酸苯甲酯、BBAB消除內(nèi)源性的熒光，德國科學(xué)家Dodt建立的3DISCO 技術(shù)能夠?qū)?nèi)源性熒光保留一段時(shí)間。Dodt也一直在研究更加穩(wěn)定的DISCO (sDISCO)，以期延長內(nèi)源性熒光保留時(shí)間。2013年，Alain Chédotal 改進(jìn)了3DISCO技術(shù)，他認(rèn)為：“3DISCO技術(shù)應(yīng)該和免疫熒光染色一樣，經(jīng)過改進(jìn)就能夠?qū)崿F(xiàn)對大組織樣品的全標(biāo)本染色”。2014年Jean-François Brunet將這個(gè)技術(shù)發(fā)表在Science雜志上。Chédotal 實(shí)驗(yàn)室的Nicolas Renier在此基礎(chǔ)上又進(jìn)行了完善，命名為iDISCO技術(shù)。

之后他又發(fā)明了iDISCO+技術(shù)，Nicolas Renier解釋了iDISCO+技術(shù)的優(yōu)勢：“采用比較溫和的辦法，盡可能地兼顧了提高透明度（需要?jiǎng)×姨幚硪匀コ荆┖捅Ａ舻鞍踪|(zhì)內(nèi)源性熒光（需要溫和處理組織）。采用iDISCO+技術(shù)，不僅能夠達(dá)到類似3DISCO水平的透明度，而且保留了更多的內(nèi)源性螢光信號，最終我們可以同時(shí)獲得偶聯(lián)的熒光素信號和有機(jī)溶液中的脂質(zhì)提取物”。iDISCO技術(shù)可以將微弱的內(nèi)源性螢光信號進(jìn)行免疫標(biāo)記，最終增強(qiáng)放大。 其他的有機(jī)溶劑的組織透明化方案比如FluoClearBABB 技術(shù)[17], uDISCO技術(shù)[18], 和ECi技術(shù)也能夠達(dá)到保留內(nèi)源性熒光的效果。uDISCO技術(shù)具有更強(qiáng)的收縮樣品能力，可以輕松實(shí)現(xiàn)大樣品——比如整個(gè)小鼠的成像。而針對某些不適合劇烈收縮的樣品，無毒性的ECi技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)更好的成像，ECi技術(shù)甚至能夠?qū)⒐趋肋M(jìn)行透明化從而實(shí)現(xiàn)對骨髓的成像。Visikol HISTO是一種商品化的可逆且無損的有機(jī)透明劑，可以實(shí)現(xiàn)對樣品的三維成像，隨后樣品還可以進(jìn)行組織學(xué)的其他處理。

總結(jié)： 優(yōu)于透明化會改變樣品本身的性質(zhì)，所以處理過程通常都會引入一定的人造假象，所以針對特定的樣品，需要對特定的方法進(jìn)行一定的優(yōu)化。相比較兩類不同的透明化方案，3DISCO技術(shù)和ECi技術(shù)耗時(shí)短、花費(fèi)少。相對于sDISCO技術(shù)、uDISCO技術(shù)和ECi技術(shù)，CLARITY技術(shù)和CUBIC技術(shù)雖然能夠較好的保留內(nèi)源性熒光、達(dá)到良好的透明化效果，但是保留時(shí)間短、花費(fèi)高也限制了其使用。對于大型組織樣品的深度成像，經(jīng)過遠(yuǎn)紅外染料如Cy7和Alexa790標(biāo)記后，采用iDISCO技術(shù)能夠得到十分出色的成像效果。而此時(shí)一般不適合用DAPI進(jìn)行染核，而改用TO-PRO-3。采用標(biāo)準(zhǔn)的脫水方法（先用乙醇然后再用甲醇）可以避免樣品收縮，降低成像背景。

光片顯微鏡的應(yīng)用領(lǐng)域

1、發(fā)育生物學(xué)： 光片顯微鏡可用于哺乳動(dòng)物發(fā)育過程胚胎的成像。

在哺乳動(dòng)物發(fā)育過程中，主靜脈血管中的內(nèi)皮細(xì)胞亞群表達(dá)淋巴管特異基因，進(jìn)而發(fā)育出初級的淋巴結(jié)構(gòu)-淋巴囊。淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的產(chǎn)生經(jīng)過了出芽，擴(kuò)展和膨脹的過程，但是淋巴管形成的確切機(jī)制仍然不清楚。使用光片顯微鏡來觀察整體免疫染色的小鼠胚胎，我們以細(xì)胞水平的分辨率觀察到了完整的發(fā)育中的血管系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞寬松地連接了主靜脈和淺靜脈叢，進(jìn)而聚集產(chǎn)生了兩個(gè)新發(fā)現(xiàn)的淋巴結(jié)構(gòu)，背部外周縱向淋巴管和腹側(cè)初級胸導(dǎo)管，最后與主靜脈相連。進(jìn)一步研究其功能，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子C和基質(zhì)組分CCBE1對于淋巴內(nèi)皮細(xì)胞出芽和遷移是必需的。有報(bào)道研究使用光片顯微鏡詳細(xì)觀察了淋巴管的發(fā)育并構(gòu)建了新的模型。

經(jīng)過幾個(gè)世紀(jì)的研究，人類的生長于發(fā)育過程中仍遺留有很多的未解之謎。人類胚胎發(fā)育的研究始于20世紀(jì)，一般以觀察胚胎的組織圖像的方式來研究如器官發(fā)生的機(jī)制等，傳統(tǒng)的方式如切片一直使用至今。現(xiàn)今，對于胚胎3D圖像的數(shù)字化構(gòu)建也已經(jīng)開始，使用核磁共振、X光攝影等方法均可獲得胚胎的3D圖像，但分辨率仍無法達(dá)到細(xì)胞水平。已報(bào)道文章，使用妊娠期6-14周的胚胎，結(jié)合免疫染色、3DISCO組織透明技術(shù)和光片顯微鏡，獲得了人類胚胎細(xì)胞級分辨率的3D圖像，清晰地顯示了胚胎的外周神經(jīng)、肌肉、血管、心、肺和泌尿系統(tǒng)。通過這種方法，我們可以建立人類生長發(fā)育的圖庫，研究人類胚胎發(fā)育的分子機(jī)制。

2、腫瘤學(xué)：光片顯微鏡可用于于腫瘤模型等樣品的成像。

惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生通常伴有血腦屏障的損壞，導(dǎo)致大分子物質(zhì)可以通過血腦屏障達(dá)到腫瘤處，然而使腫瘤處的藥物達(dá)到濃度仍是腦瘤治療的難題，需要對腫瘤處的藥物活性進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)使用了非侵入性的成像方法對細(xì)胞凋亡進(jìn)行縱向監(jiān)測來研究注射的DR5抗體在腦瘤異體移植模型中的穿透性和藥效性。腦瘤模型通過植入表達(dá)熒光素酶的腫瘤細(xì)胞系建立。對細(xì)胞凋亡進(jìn)行實(shí)時(shí)記錄，并通過光片顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，不到1%的抗體到達(dá)了腫瘤處，而引發(fā)的細(xì)胞凋亡在24小時(shí)內(nèi)迅速降低，然而結(jié)果表明了抗腫瘤的效 果的存在，且抗體的穿透性隨血腦屏障的損壞而上升。光片顯微鏡能夠?qū)崿F(xiàn)腦瘤中的抗體聚集和藥效性的量化，用于評估中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶向藥物。

3、神經(jīng)生物學(xué)：光片顯微鏡可用于于腦組織等樣品的成像。

當(dāng)研究小鼠腦部同時(shí)需要保留其3D結(jié)構(gòu)時(shí)，則需要對腦做組織透明。3DISCO是一種非常簡單的組織透明化技術(shù)，經(jīng)常用于表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因鼠腦組織。3DISCO技 術(shù)在與光片顯微技術(shù)結(jié)合后可以快速地生成軸突束的三維圖像。然而，像GFP的熒光在透明化后會迅速地消失。盡管有多種組織透明化技術(shù)可很好地保持熒光強(qiáng) 度，這些方法往往很復(fù)雜，耗時(shí)長達(dá)數(shù)天甚至數(shù)周，而且適用范圍較小。經(jīng)過試驗(yàn)，在對腦組織進(jìn)行免疫染色后再進(jìn)行3DISCO透明化，可以使熒光染料保持活性長達(dá)數(shù)月，并同時(shí)保證了實(shí)驗(yàn)效率。有報(bào)道，研究人員使用了光片顯微鏡和共聚焦顯微鏡。光片顯微鏡使用單側(cè)光源對后屈束和松果體韁成像僅用了10分鐘；使用雙側(cè)光源對全腦成像僅用時(shí)1小時(shí)。而共聚焦顯微鏡僅對后屈束成像就使用了4小時(shí)。使用光片顯微鏡顯著提高了成像速度。

4、模擬疾病模型：光片顯微鏡可用于于疫病相關(guān)的組織器官等樣品的成像。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)在能量代謝中發(fā)揮著重要的作用；當(dāng)這樣的神經(jīng)調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)問題時(shí)會使得能量代謝失去平衡，產(chǎn)生肥胖、二型糖尿病或其他的失調(diào)現(xiàn)象。白色脂肪組織是機(jī)體代謝平衡調(diào)節(jié)的重要組成部分。機(jī)體生理狀態(tài)下，以脂肪形式存儲和釋放能量，維持代謝穩(wěn)態(tài)。白色脂肪組織在生理和病理?xiàng)l件下發(fā)生顯著變化，對整體的代謝穩(wěn)態(tài)和系統(tǒng)性炎癥產(chǎn)生廣泛影響，深入了解其調(diào)控機(jī)制對于理解和治療肥胖癥、2型糖尿病等代謝類疾病有著重要指導(dǎo)意義。研究顯示，在低溫條件下，白色脂肪組織發(fā)生明顯的細(xì)胞及分子水平變化，高表達(dá)Ucp1蛋白的細(xì)胞類型數(shù)目明顯增多，而該類細(xì)胞被認(rèn)為在調(diào)節(jié)代謝平衡中發(fā)揮重要功能。在該報(bào)道的研究中發(fā)現(xiàn)，白色脂肪組織中分布高密度的交感神經(jīng)纖維，并且低溫條件刺激激活交感神經(jīng)元，其活動(dòng)對白色脂肪組織在低溫刺激下的棕化反應(yīng)有重要促進(jìn)功能，揭示了白色脂肪組織受神經(jīng)活動(dòng)調(diào)控的重要生理基礎(chǔ)。

類器官串聯(lián)芯片培養(yǎng)系統(tǒng)--- HUMIMIC的應(yīng)用案例     

HUMIMIC應(yīng)用案例-1：神經(jīng)球和肝臟在芯片上的串聯(lián)共培養(yǎng)
2015, Journal of Biotechnology, 
A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing

目前用于藥物開發(fā)的體外實(shí)驗(yàn)平臺無法模擬人體器官的復(fù)雜性，而人類和實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的系統(tǒng)差異巨大，因此現(xiàn)有的方案都不能準(zhǔn)確預(yù)測藥物的安全性和有效性。德國、葡萄牙和俄羅斯的研究團(tuán)隊(duì)通過TissUse GmbH公司的微流控多器官芯片（MOC）平臺，測試毒物對多器官的作用，揭示了基于微流控的多器官串聯(lián)共培養(yǎng)能夠更好的模擬人體的生理學(xué)環(huán)境。在體外培養(yǎng)條件下，由于氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)有限，類器官培養(yǎng)往往會隨著時(shí)間的推移而去分化。然而微流控系統(tǒng)中通過持續(xù)灌注培養(yǎng)基，更好地控制環(huán)境條件，如清除分泌物和刺激因子，并且培養(yǎng)基以可控流速通過，以模擬血流產(chǎn)生的生物剪切應(yīng)力，因此類器官培養(yǎng)物可以保持良好的生長狀態(tài)。

雙器官串聯(lián)芯片（2-OC）能夠串聯(lián)共培養(yǎng)人的神經(jīng)球（NT2細(xì)胞系）和肝臟類器官（肝HepaRG細(xì)胞和肝HHSteC細(xì)胞）。在持續(xù)兩周的實(shí)驗(yàn)中，反復(fù)加入神經(jīng)毒劑2,5-己二酮，引起神經(jīng)球和肝臟的細(xì)胞凋亡。跟單器官培養(yǎng)相比，串聯(lián)共培養(yǎng)對毒劑更敏感。因此，多器官串聯(lián)共培養(yǎng)在臨床研究中可以更準(zhǔn)確地預(yù)測藥物的安全性和有效性。推測這是因?yàn)橐粋€(gè)類器官的凋亡信號導(dǎo)致了第二個(gè)類器官對藥物反應(yīng)的增強(qiáng)，這一推測得到了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支持，即串聯(lián)共培養(yǎng)的敏感性增加主要發(fā)生在較低濃度藥物中。

HUMIMIC應(yīng)用案例-2：四器官串聯(lián)芯片（4-OC）

Autologous induced pluripotent stem cell-derived four-organ-chip. 
2019, Future Science OA

在體內(nèi)，每個(gè)器官都保持著自己的獨(dú)立性，同時(shí)通過血液中的細(xì)胞和因子，與其他器官保持相互通訊。保持體外培養(yǎng)物的表型的同時(shí)，如何維持組織和器官間的通信一直是該領(lǐng)域的一個(gè)挑戰(zhàn)。所以，將幾種類器官串聯(lián)在一個(gè)共同的培養(yǎng)基的循環(huán)中，通過分泌的因子進(jìn)行通訊和交流。模擬多器官之間的交流，可以研究每個(gè)器官代謝的產(chǎn)物對其他器官產(chǎn)生的影響，以及環(huán)境因子對于多器官的系統(tǒng)性效應(yīng)。