PCR反應所需細菌DNA 模板的制備

從分析的標本中純化核酸，即制備PCR反應的模板，是使PCR獲得成功的重要的*步。由于PCR的用途各異，用于抽提核酸的起始材料種類可能差異很大（包括新鮮的、儲存的和古代的）。每種特殊樣品類型有各自的限制和抽提核酸的不同要求，但它們都有一個共同的標準，擴增的靈敏性要求特別注意不同材料、PCR產物、質粒或對照之間可能存在的交叉污染。由于PCR不需要高分子量和高度純化的核酸，為zui大限度材料污染的機會，可以使用快速而且簡便的提取方法。

【試劑與配制】

TE緩沖液（pH8.0）

裂解緩沖液：2%SDS，10μg/ml蛋白酶K溶于TE中。

RNase A （10mg/ml）

平衡酚

：（24：1）

無水乙醇

70% 乙醇

3mol/L 乙酸鈉（pH5.2）

【操作方法】

1、方法一

（1）從平板上挑取至少1.5mm的菌落到一微量離心管中，加入400μl裂解緩沖液，混勻;

（2）55℃～60℃，水浴15～20min;

（3）加入等體積的酚：：（25：24：1），混勻;

（4）5000g離心10min;

（5）吸取上層水相，再加入等體積的：（24：1）;

（6）重復（3）～（4）;

（7）吸取上層水相，加1/10體積3mol乙酸鈉及RNase A（終濃度為0.25～0.3μg/μl），輕搖，37℃保溫30 min;

（8）加入2.5倍體積的預冷無水乙醇，-20℃ 2hr;

（9）10,000g 離心15min，棄上清，或用無菌細玻棒攪纏出DNA;

（10）70% 乙醇洗2次，待乙醇蒸干后重新溶于小體積去離子水或TE緩沖液中（約20μl）。一次取5～10μl進行PCR反應。

2、方法二

（1） 取一定數量的細菌加入500μlTE緩沖液中;

（2） 100℃煮沸10min，置冰浴保存;

（3） 10,000rpm，4℃離心10min;

（4） 取適量上清作為PCR 模板。

3、方法三

（1） 制備一定濃度的細菌/去離子水懸液，反復凍融3次;

（2） 10,000rpm，4℃離心10min;

（3） 取適量上清作為PCR 模板。