研生試劑-子宮內膜ER、PR檢測技術

前幾年國內大多采用親和組化法和多克隆抗體的免疫組化方法測定組織中ER和PR，其結論一直存在爭論。近幾年也開始應單克隆抗體測定冰凍切片中的ER、PR，但應用常規的免疫組化法測定石蠟標本中ER和PR不能獲得滿意的結果。本研究設計不同實驗條件下，在石蠟切片中ER、PR的免疫組化染色，旨在探索*的ER、PR免疫組化染色條件。

1　材料和方法

1.1　材料　獲取月經周期規則，血內分泌激素測定正常的增生晚期(周期第13天)子宮前、后壁內膜各一條，立即放入10%緩沖福爾馬林(pH 7.4)固定液內，24 h內行石蠟包埋。
1.2　試劑　抗ER、PR單抗，S-P試劑盒和多聚-L-賴氨酸膠(均由福州邁新生物技術開發公司提供)。
1.3　方法　(1)在清潔玻片涂上一層多聚-L-賴氨酸膠，待其自然干燥；(2)將石蠟標本4 μm厚切片，常規脫蠟；(3)加3%過氧化酶阻斷劑50 μl，室溫下放置10 min，用蒸餾水沖洗2次，每次3 min；(4)微波下抗原修復：將片子浸放于0.01 mol.L-1的檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中置于微波爐內加熱至95℃，10 min，冷卻至室溫，用PBS沖洗2次，每次3 min；(5)加10%正常兔血清50 μl，在室溫下孵育10 min，吸去多余液體；(6)加*抗體(簡稱一抗，為即用性抗ER或PR的單抗)50 μl放置于4℃的冰箱中過夜，用PBS沖洗2次，每次3 min；(7)加生物素標記的第二抗體(兔抗鼠單抗)50 μl，置室溫下10 min，用PBS沖洗2次，每次3 min；(8)加SP溶液50 μl，置室溫下10 min，用PBS沖洗2次，每次3 min；(9)加新鮮配制的DAB 100 μl，顯色1～2 min；(10)用自來水沖洗終止顯色，脫水，封片。
為探索ER和PR染色的*條件設立以下對照：(1)用Elmer?s Glue涂膠對乳腺癌的石蠟標本切片8張；(2)常用10%福爾馬林固定24 h以上28張(玻片號ER5、ER6、PR4、PR5)；(3)不用微波處理5張玻片號為ER3、ER4、ER6、PR3、PR5)；(4)加一抗后半小時再加第二抗體5張(玻片號為ER2、ER3、ER6、PR2、PR5)。
1.4　結果判斷　把封固好的切片置于光鏡下，用低倍和高倍鏡觀察，陽性細胞為細胞核內有棕色顆粒，根據著色深淺依次為“?”、“?”、“＋”和“-”〔2〕。

2　結果

2.1　不同涂膠對免疫組化測定的影響　應用Elmer?s Glue液涂膠的切片，經微波處理，或沒有用微波處理都發生脫片或部分脫片。而用多聚-L-賴氨酸涂膠的待實驗結束后全部完好無損，無脫片現象。
2.2　影響因素　不同固定液、固定時間，微波處理與否以及不同的一抗作用時間對免疫組化測定結果的影響，見表1和圖1～4。

圖1（玻片號ER1）用緩沖福爾馬林固定液，24h內行石蠟包埋，經微波抗原修復，加一抗后4℃冰箱中過夜,ER染色呈強陽性(+++)。S-P×40

圖2（玻片號ER3）不經微波處理，其它同圖1，ER染色呈陰性（-）。S-P×40

圖3（玻片號PR1）方法同圖1，PR染色呈強陽性（+++）。S-P×40

圖4（玻片號PR3）不經微波處理，其它同圖1，PR染色呈弱陽性（±）。S-P×40

表1　不同條件下ER和PR免疫組化染色的結果

玻片號 切片數 固定液和

固定時間

微波處理 作用時間 染色結果
ER染色
ER1 16 1 1 1 +++
ER2 1 1 1 2 -
ER3 1 1 2 1 -
ER4 1 1 2 2 -
ER5 13 2 1 1 -
ER6 1 2 2 2 -
PR染色
PR1 16 1 1 1 ++
PR2 1 1 1 2 ++
PR3 1 1 2 1 ＋
PR4 13 2 1 1 +++
PR5 1 1 2 2 ＋

注：“1”表示實驗組；“2”表示對照組

3　討論

本實驗結果顯示，ER和PR定位于陽性組織和細胞核內，胞漿中無ER、PR染色，這與文獻報道一致〔1，2〕。目前國內大多采用親和組化法或抗ER、PR多抗測定石蠟標本中的ER和PR分布，它通過顯示雌激素(E)或孕激素(P)間接反映ER和PR水平，測定結果與應用單抗免疫組化法不同，在胞漿和胞核內均有陽性染色，因此不能排除E或P與細胞內非受體蛋白結合的可能性，推測這些陽性細胞可能部分是E或P與細胞內非受體蛋白結合，并非活性ER、PR，甚至是E或P本身〔3〕，
筆者體會，石蠟切片上成功顯示ER、PR關鍵是：(1)抗原保護：10%緩沖福爾馬林(pH 7.4)固定液，24 h之內行石蠟包埋，優于常規的福爾馬林固定液。固定時間過久，免疫組化染色結果差〔3〕；(2)抗原修復：微波的應用解決了過去一直認為ER、PR一旦經石蠟切片制作過程抗原即遭破壞，而只能在冰凍切片上進行的困難；(3)一抗作用時間：在4℃冰箱中過夜，比室溫下作用30 min免疫組化染色效果明顯增強，特別是ER，而PR免疫組化測定要求相對較低，可能是ER較PR不穩定，易受破壞，丟失。另外，發現石蠟切片經微波處理，并反復沖洗，易發生脫片，多聚-L-賴氨酸涂膠，較常用的Elmer?s Glue涂膠好，很少發生脫片現象。
作者應用該方法研究克羅米酚對子宮內膜ER、PR的影響獲得較為滿意的效果〔4〕。該技術的應用將推動生殖內分泌的研究，在臨床上為乳腺癌、子宮內膜癌的治療和預后判斷提供客觀的病理依據。