細胞培養基DNA覑段自主克隆復制研究

    DNA覑段的克隆需要合適的載體，載體或是質粒，或是噬菌體，或是病毒，通常大多經過人工改造[地的。作為載體必須具備兩條件：一是該載體在細胞培養基內必須能自主復制，即必須具備復制原點；二是該載體必須具備適合的酶切位點，且這些酶切位點不在復制原點區域內。以上兩條，保證了載體的可繁殖性和可利用性。為了便于獲得陽隆克隆，載體上常有篩選標記，如對抗菌素的抗性，某些基因產物的顯色反應等。

　　一、質粒

　　常用的有pBR322，pUC系列質粒等。

　　（一）pBR322質粒是4362bp的環狀雙鏈DNA載體，有2個抗藥性基因（四環素和氨芐青霉素），一個復制起始點和多個用于克隆的限制酶切點。當缺失抗藥性基因的大腸桿菌被pBR322成功地轉化時，它便從該質粒獲得了抗生素抗性。兩個抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的單一酶切位點。一般只選一個抗生素基因作為插入外源DNA之用。外源DNA插入后該抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因則作為轉化細菌后篩選陽性克隆之用。

　　（二）pUC系列質粒是2.7Kb的雙鏈DNA質粒，有一個復制起點，一個氨芐青霉素抗性基因和一個多克隆位點，多克隆位點處于表達LacZ基因產物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段，用pUC質粒轉化LacZ基因有突變的大腸桿菌株（M15）時，因為由質粒表達的α－肽補充了大腸桿菌卻失的α－肽，所以恢復了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培養基上，長出藍色克隆。如果在多克隆位點內插入外源DNA，由于它破壞了α－肽的表達，因而在加入IPTG和X－gal的培養基，不能長出藍色克隆，這就是所謂的藍白篩選。