培養基研究促細胞分裂劑實驗說明

　　通過促細胞培養基分裂劑與細胞表面受體相互作用，在體外觸發細胞的多克隆激活。根據所使用的促細胞分裂劑的不同，應答細胞可以是T淋巴細胞、B淋巴細胞，或兩者同時，或者是單核細胞。細胞激活可以通過細胞增殖、細胞因子分泌、表面抗原表達和/或細胞體積的增加進行檢測。例如在使用B細胞激活劑時，可以通過多克隆免疫球蛋白的分泌進行檢測。

　　操作步驟：

　　（一）促細胞分裂劑制備

　　根據說明書將促細胞培養基分裂劑重新溶解于水或培養液中，制成儲存液（如100´），保存于-20℃。

　　（二）促細胞分裂劑滴定

　　1．在培養液中稀釋儲存液到所需的*個濃度，通常為理論*濃度的10倍；

　　2．在培養基板或試管中直接將促細胞分裂劑進行濃度遞減系列稀釋（100 μl/孔）；

　　3．每孔平行重復三次；

　　（三）細胞激活

　　1．分離外周血單核細胞培養基；

　　2．室溫下用培養液300´g離心10分鐘，收集并洗滌細胞；

　　3．計數細胞并將細胞在培養液中重新懸浮至106細胞/ml，在培養板中每孔加入100μl；

　　4．在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育（細胞增殖需2-3天；細胞因子測定測定6小時-2天；免疫球蛋白分泌測定需5-10天）；

　　（四）細胞激活定量測定方法

　　1．培養基增殖檢測方法采用MTT測定法；

　　2．細胞因子分泌測定或使用市售商業化試劑盒；

　　3．免疫球蛋白分泌測定采用ELISA檢測