步驟
1.  從冷藏室取出7 μm 的凍干切片并立刻放入冰冷的丙酮中浸泡10分鐘。注，可選的固定條件依賴于所使用的抗原及一抗。常用的固定劑有甲醛、丙酮及甲醇。

2.  用PBS洗滌載片后吸干組織周圍的水份，使載片干燥。小心地用PAP筆繞組織圈出輪廓。

3.  將切片用含有0.05%TitonX-100的PBS混合10%的馬血清溶液在室溫下封閉1小時。

4.  吸干封閉緩沖液，切片放入濕盒中與含有0.05%TritonX-100的PBS配制的2%馬血清溶液稀釋的*抗室溫體孵育1小時。用足量的抗體溶液*浸沒切片，約150微升。提示,按照推薦方法稀釋抗體。

5.  吸去*抗體并用150 μl 的PBS/TritonX-100緩沖液洗滌5次。

6.  切片在濕盒中與相應的第二熒光抗體AlexaFluor488/55ntibody（MolecularProbes）室溫孵育1小時。二抗用含有0.05%TritonX-100的PBS配制的2%馬血清溶液稀釋，比例為1：300，用足夠量的二抗溶液（約150 μl）以*浸沒切片。

7.  吸去二抗并用150 μl 的PBS/TritonX-100緩沖液洗滌2次。

8.  用150 μl 的PBS緩沖液洗滌切片3次。

9.  將切片與Hoechst 33342核染料[2 mg/ml 溶于PBS中]孵育2分鐘。

10.  吸去二抗并用150 μl 的PBS緩沖液洗滌3次。

11.  讓切片干后，每個切片中加約2滴的ProLongGold抗褪色試劑，蓋上蓋玻片。注意，要小心避免太過滑動蓋玻片而損壞組織，不要造成氣泡。吸去多余的試劑。

12.  避光放置在室溫下幾個小時或過液讓切片干燥。一旦載片*變干，用干凈的指甲油封住蓋玻片的邊沿。封片可以避光存放于-20°C幾周時間。抗體