一、二步法

1. 原理

為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結合，形成酶--免疫球蛋白結合物。

2. 標記步驟

（1）稱取HRP25mg溶于1.25%溶液中，于室溫靜置過夜。

（2）反應后的酶溶液經Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/1分鐘，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。

（3）將待標記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。

（4）用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續攪拌3小時。

（5）加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時。

（6）在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃ 1小時。

（7）3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，zui后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。

（8）將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4的PBS緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，分裝后，冰凍保存。

3. 結果判定

（1）定性及效價滴定：用特異性抗原(或抗體)同酶標記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴散試驗或免疫電泳試驗。然后用酶的底物使沉淀弧顯色，可初步鑒定其活性。zui后以直接ELISA法(或在正式實驗系統里)對酶結合物進行滴定( 見本節 (三)工作濃度的選擇)。

（2）定量和克分子比值測定：可用分光光度計測定(光程1cm)。

酶量(mg/ml)＝OD403nm×0.4

IgG量(mg/ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62抗體

（3）本法標記步驟比較簡單，重復性好。缺點是酶的利用率低，一般只有2-4%的酶與蛋白質結合。