要一次進行這么多種反應，我們當然不想在反應中缺了哪個組分。一般多重PCR需要更多的dNTP、鎂離子和聚合酶。Nichols推薦使用0.3 mM dNTP（而非標準的0.2 mM）、2.5 mM Mg2+（而非1.2至2 mM）以及每50μL反應體系5 units聚合酶（而非1.25 units）。zui后再試試鹽濃度，“在優(yōu)化的時候，增加鹽總會有幫助，尤其能增加特異性。”ELISA試劑盒

    PCR master mix含有緩沖液、鹽、dNTP、Mg和聚合酶，如果我們使用常規(guī)1.25× 或1.5×的PCR master mix就已經(jīng)差不多做到了上述原則的三至五。另外，您還可以選用轉(zhuǎn)為多重PCR優(yōu)化的產(chǎn)品，例如NEB的多重PCR 5× Master Mix、Bio-Rad的iQ? Multiplex Powermix、或者安捷倫的Brilliant Multiplex QPCR Master Mix。

    據(jù)安捷倫的Mason介紹，Brilliant Multiplex QPCR Master Mix是經(jīng)過專門設計的，能夠很好的解決同一管中不同反應相互競爭的問題。如果一個目標片段出現(xiàn)1000次，而另一個目標片段只出現(xiàn)了10次，那么后一個片段就很容易淪為背景。“我們的多重PCR試劑盒能夠在同一個管中準確定量低豐度和高風度的目標片段，克服偏向性，”Mason說。

    我能擴多少目標片段一般來說，zui多能在同一個管中同時檢測到五個目標片段，這既是出于引物設計的考慮，也是由多重定量PCR的硬件條件決定的。實時熒光PCR儀通常zui多檢測4至5個顏色通道，其中一個可能還要留作參考通道。凝膠電泳雖然不受此限制，但多引物一同作用仍然存在困難，因此還是zui多達到五重PCR。 “設計更多是挑戰(zhàn)性的，”Cockrum說。
  

    多重定量PCR的染料能進行多重定量PCR的儀器包括：Life Tech公司的QuantStudio? 12K Flex Real-Time PCR System、安捷倫公司的Mx30005P等等。目前zui流行的選擇是HEX、FAM和VIC，而FAM/HEX和FAM/VIC是用的zui普遍的。Life Tech除了VIC外，近期又發(fā)布了兩個新染料ABY和JUN以及一個新passive reference dye——Mustang Purple。ELISA試劑盒

    Cockrum建議將染料強度與模板豐度結(jié)合起來，用zui亮的染料（通常是FAM）配zui少的模板，用zui黯淡 的染料（例如Cy5或Quasar 705）配豐度zui高的模板（如看家基因）。

    更多重的PCR當然，引物設計是多重PCR的zui大障礙，不過一旦克服了這一障礙我們就能進行更多重的PCR反應。安捷倫的MassCode技術就能夠超越定量PCR儀帶來的硬件限制，安捷倫公司將這一技術推薦給那些想要同時篩選十個以上目標片段的用戶，例如可以用來檢測病原體。ELISA試劑盒