Western Blotting實驗過程中使用內參的方法

*種是超級簡便的標記內參使用法，TSZelisa試劑盒只要在二抗孵育時加入HRP標記內參抗體，按照正常操作即可;

第二種是普通內參，當目的蛋白的分子量大小與選用的內參蛋白分子量相差不大時，可以先進行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測，然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進行內參蛋白的抗體溫育、顯色檢測。

第三種，當目的蛋白的分子量大小與選用的內參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉膜后預染，根據(jù)蛋白質Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分，使內參蛋白與目的蛋白分開，然后兩塊膜分別與內參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進行溫育，二抗溫育以及顯色。

actin即肌動蛋白，是細胞的一種重要骨架蛋白。actin大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余兩種廣泛分布于各種組織中，包括beta-actin(β- non-muscle)和gamma-non-muscle actin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的，在肌肉組織中的beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的組織本來就應該選擇不同的內參，不能一概而論的。beta-actin作為內參是得到了*的，TSZelisa試劑盒這是針對大多數(shù)組織和細胞來說的，它廣泛分布于細胞漿內，表達量非常豐富。盡管zui近有一些文章已經(jīng)開始質疑beta-actin作為內參的有效性(好像是對于上樣量>20ug的蛋白區(qū)分能力下降，記不清楚了)，但是發(fā)文章應該還是沒有問題的。至于其他的內參也是可以考慮用的，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)是參與糖酵解的一種關鍵酶，而tubulin和actin類似，是細胞骨架的組成部分，但是不是肌肉的主要成分，應該是一個代替品。三種同時發(fā)生變化的情況很少，需要具體分析。一旦出現(xiàn)上述三種內參同時發(fā)生變化，如果是總蛋白可以用胞核的內參如PCNA，TATA-box bingding protein(TBP)甚至線粒體的內參來代替，當然一般這種可能性出現(xiàn)的幾率微乎其微。

actin幾種異構體存在組織分布特異性，不同型actin之間具有較高的序列相似性(>90%)。β-actin是分布于非肌細胞中的一種骨架蛋白，選擇作β-actin內參時首先得保證是組織廣泛表達的(尤其是做蛋白的組織表達譜時)。那么制備β-actin抗體的抗原應該是選用與actin其它異構體一致的氨基酸序列。公司制備抗體是選用beta-actin的某一段小短肽作為免疫原，可能會因為選取的短肽在不同型actin之間保守與否,而導致所制備抗體具有一定的組織特異性.如選取的短肽僅在beta型存在,所得抗體就僅能檢測非肌細胞中的actin,而選取的短肽在六型中均存在,則此抗體除非肌細胞外,TSZelisa試劑盒還可以檢測cardiac，skeletal，smooth muscle細胞的actin。