通過快速敏感的液相色譜-質譜法串聯測定大鼠血漿中的人參皂甙Rb1，Rb2 和Rb3：在藥代動力學研究中的應用

摘要

為了確定分別口服給藥（

50

毫克

/

千克）和靜脈給藥（

10

毫克

/

公斤）的

RB1

，

RB2

，和

R b3

后的大鼠體內人參皂苷

RB1

，

RB2

，

和

R b3

的藥代動力學，

開發了一種靈敏快速液相色譜

- 

串聯質譜法。血漿樣品用皂苷

Rg2

為內標的飽和的正丁醇進行萃取。色譜分離，

Zorbax 

SB-C18

柱

（

50

毫米×

4.6

毫米，

1.8

≤

M

）

；

流動相，

甲醇

-1 mM

甲酸銨

（

74:26 

，

V / V

）

。

使用

RB1

，

RB2

和

RB3

分別為

M / Z 1107.7

→

M / Z = 178.9 

，

M / Z 1077.7 

→

M / Z 148.6 

，

與

m/z1077.7 

→

M / Z 783.4

的碎片轉換進行多反應監測模式。校正曲線在

20-1000

納克

/

毫

升的

RB1

和

R B2 

，

和

50-2500

納克

/

毫升為

Rb3

的濃度范圍回收。

檢出限分別為

3.0 ng / ml

和

4.0

納克

/

毫升和

6.5

納克

/

毫升。

3

種人參皂甙的日內及日間變異均小于

15 

％

，準確度

在

86-114 

％。所有

3

種人參皂苷具有差的口服生物利用度（

RB1

，

RB2

，和

R b3

分別為

0.78

％

，

0.08

％

，

和

0.52

％）

。

皂苷

Rb1

的值比甙

Rb2 

或

Rb3

的更高，

表明通過口服給藥，

帶有己糖和羥基的人參皂甙（

RB1

）可以比那些在相同的糖基化位點帶有戊糖基團的呈現

更好的藥代動力學行為。

1.

說明

人參皂甙已被視為三七藥材的藥理作用的主要活性成分

[1]

。三七提取物中，人參皂甙

Rb1

是主要皂甙，甙

Rb2

和

Rb3

是其他小的成分。這三種人參皂甙均為

20

（

S

）

- 

原人參

二醇皂苷（

PPD

）

，并具有相同的糖基化位點（

C-3

位點，

C-20

位點）

。區別僅在于連接到

C-20

位點的糖苷。皂苷

Rb1

連接有兩個葡萄糖，

RB2

連接有一個葡萄糖和一個

α

-L-

吡喃阿

拉伯糖基，和

R b3

連接有一個葡萄糖和一個

β

-D-

木糖（圖

1

）

。

到現在為止，

人參皂苷的藥代動力學特性已經出版了許多文獻。

劉等人。

發現，

RB1

，

RB2

，

Rc

和

Rd

靜脈給藥后均迅速在大鼠腦，肌肉和神經組織分布

[2]

。

Song

等。報道

R1

，人參

皂苷

Rg1

和

Rb1

經犬口服后的藥代動力學研究。結果表明，皂苷

Rb1

的

Cmax

為

28.6

納克

/

毫升

[3]

。

Chen

等人，報道稱，

皂甙

Rb1

的

T1 / 2

比

Rg1

和

R1

的更長

[4]

。

皂苷

Rb1

的生物

利用度一直

報道為

4.35

％

[5]

。在

Ra3

，皂苷

Rb1

，

Rd

，

Re

，皂苷

Rg1, R1

的吸收和分布的

研究中，表明，大多數人參皂甙是受到廣泛迅速膽汁排泄，導致他們的短

T1 /2

值

[6]

。

雖然皂苷

Rb1

的藥代動力學特性已知，

RB2

和

Rb3

的信息是罕見的。實際上，關于甙

Rb2

和

Rb3

的藥代動力學行為的有限的信息已經發布。因此，

RB2

和

Rb3

的藥代動力學的研究

是必要的，

有助于澄清藥代動力學和人參皂甙結構偏好之間的關系。

由于人參皂甙在吸

收

203 nm

處有較差的紫外輻射

[5]

。

的液相色譜

- 

質譜

（

LC-MS

）

[7-9]

和液相色譜

- 

串聯

質譜（

LC-MS/MS

）

[10-12]

的方法被廣泛用于分析人參皂甙。

在這項研究中，我們開發了一個簡單，快速，靈敏的

LC-MS/MS

方法來確定口服和靜脈三

個人參皂苷給藥后，

RB1

，

RB2

，和

R b3

的血漿濃度，并進行系統的比較三種人參皂甙藥

代動力學行為的相似性和差異。

2.

材料和方法

2.1

化學藥品及試劑

人參皂苷

Rb1

，

Rb2

、

Rb3

，和

Rg2

，

（內標，

IS

）

（

99%

）是從化學學院，吉林大學（長春，

中國）

。從安捷倫科技得到了甲酸銨。其他試劑是

HPLC

級。

2.2

儀器和分析條件

將

Agilent 1200

快速分離

HPLC

系統與配有電噴霧電離

（

ESI

）

的安捷倫

6410

三重四極桿質

譜儀串聯。該柱是

Agilent ZORBAX SB-C 18

柱（

50

毫米×

4.6

毫米，

1.8

≤

M

）

。流動相：甲

醇和

1 mM

甲酸銨（

74:26

，體積

/

體積，

pH

值

6.0

）

，流速為

0.4

毫升

/

分鐘。對

RB1

，

RB2

，

RB3

和

IS

分別

M 

/ 

Z1107.7

→

M 

/ 

Z 

=178.9

，

M 

/ 

Z1077.7

→

M 

/ 

Z 

=148.6

，

M 

/ 

Z1077.7

→

m/z783.4

，和

m / z783.6

→

M / Z475.1

的負多反應監測來進行定量。

RB1

，

RB2

，和

R b3

的

裂解

/

碰撞能量的值分別在

250 V/55 V

，

210 V/67 V

，

200 V/58 V

。

流速，

9

升

/

分鐘

;

霧化壓力，

40

磅；氣體溫度，

350?C

。

2.3

校準曲線和血漿樣品的制備

標準曲線的制備用原液對空白大鼠血漿加標至濃度：

Rb1

和

Rb2

為

20

，

50

，

100

，

500,1000

納克

/

毫升，

RB3

為

50

，

100

，

500

，

1000

，和

2500

納克

/

毫升復用。樣品（

100

微升）與

IS

溶液（

1

微克

/

毫升，

10

微升）混合，用

900

微升飽和的正丁醇萃取。以

13,000

×

g

的離心

10

分鐘后，將上清液在氮氣流中蒸發濃縮至干。將殘余物溶解在

100

微升流動相中，并離

心

10

分鐘。取

20

微升的上清液注入到

LC-MS/MS

。

2.4

方法學驗證

基體效應是通過濃縮到標準溶液的當量濃度后的物標的響應的比較來評估。

QC

樣品制備為

三種濃度：

Rb1

、

Rb2

為

50

，

100

，和

1000ng/

毫升；

Rb3

為

100

，

500

，

2500ng/

毫升。在大

鼠血漿中的

QC

樣品（

N 

= 

5

）日內和日間的檢測在三個獨立的天評估。通過將在相同的濃

度的

QC

（

n = 5

）樣品中的分析物，與后提取的空白大鼠血漿中被加標后的分析物的響應的

比較，確定了萃取回收率。

QC

樣品（

N = 3

）被測定，在長凳上室溫下放

8

小時，做凍融–

處理重復三次，處理后樣品的穩定性。

2.5

在大鼠體內的藥代動力學研究

SD

大鼠（

200

–

220 

g

）由廣東省實驗動物中心提供（廣州，中國）

。所有的研究是由南方醫

科大學倫理委員會批準。大鼠隨機分為六組：三組分別經尾靜脈靜脈注射（

10

毫克

/

公斤）

Rb1

，

Rb2

、

Rb3

，另外三組分別口服人參皂苷

Rb1

，

Rb2

、

Rb3

（

50

毫克

/

公斤）

。血液樣品

在

0.083

，

0.25

，

0.5

，

1

，

2

，

4

，

6

，

8

，

12

，

24

和

36 h

收集（

IV

）

，和

0.25

，

0.5

，

0.75

，

1

，

1.5

，

2

，

3

，

4

，

6

，

8

，

10

，

12

，

24

，

和

36 h

（

PO

）

。

血液樣品應立即離心，

直到分析前在

−20?C

存儲。

3.

結果和討論

3.1

方法學驗證

在

Rb1

、

Rb2 20

–

1000ng/

毫升和

Rb 350

–

2500ng/

毫升的濃度范圍內校準曲線為線性。檢測

限（

LOD

）為

3ng/

毫升，

4ng/

毫升，和

6.5ng/

毫升

基體效應的結果是在

90

–

112%

（

n 

= 

5

）范圍。日內和日間的準確度在

86

–

114%

，精密度

均在可接受的范圍內，在三種濃度（

n = 5

）下。提取回收率在

52

–

117%

。在穩定性評估時

所有樣品顯示小于

15%

（

RSD

）的變異。

3.2

藥代動力學研究中的應用

該方法已成功地應用于

Rb1

，

Rb2

、

Rb3

在大鼠的藥代動力學研究。藥代動力學參數（表

1

）

采用

DAS2.0

軟件的非房室模型計算。

血漿濃度隨時間的分布如表

2

所示。

Tmax

結果表明，

Rb3

吸收zui快，

Rb1

是zui慢的。靜脈注射后的

T1 / 2

表明，三種人參皂甙在體內消除緩慢。

相比之下，

Rb1

的消除是zui快的，而

Rb3

zui慢。口服給藥后

Rb1

的

AUC0

–

36 

h

值，大約

比

Rb2

大

10

倍，比

Rb3

大近兩倍，這表明在大鼠

Rb1

的吸收比

Rb2

、

Rb3

高得多。生物利

用度為，

Rb1 0.78%

，

Rb2

的

0.08%

，和

Rb3 0.52%

，所有三種人參皂苷，口服吸收差。由于

系統地比較了三種人參皂苷藥代動力學特征，

我們推測人參皂苷的藥代動力學行為有結構偏

好性。特別是，帶己糖和羥基的人參皂甙（

RB1

）比那些在相同的糖基化位點帶有戊糖基團

的可以更好的口服吸收。

4.

結論

一種簡單，

快速，

敏感的

LC

–

MS / MS

方法被開發為了大鼠血漿中人參皂苷含量的測定，

。

該法已成功應用于在大鼠的

Rb1

，

Rb2

、

Rb3

的藥代動力學研究。三種人參皂甙具有較差的

生物利用度。人參皂苷藥代動力學行為的結構偏好。